过去十年来，新陈代谢的综合研究取得了长足的进步。质谱技术（MS）通过同时测量多种代谢物发挥了核心作用。通过稳定同位素示踪技术追踪代谢物标记，还可以揭示代谢途径的活动。

2018年，普林斯顿大学 Joshua D. Rabinowitz 课题组在国际顶级期刊《Cell》上发表了题为“Metabolomics and Isotope Tracing”的论文。在该文章中，研究人员描述了质谱技术对代谢物测量的基本原理，包括样品准备、代谢组学分析和数据解释。此外，通过成功实验的例子，强调了代谢组学和同位素示踪在揭示生物学方面的方式。

背景

然而，通过代谢组学测量代谢物浓度只能说明一半的问题。同样重要的是理解代谢途径的活动，这可以用单位时间内的物质流量来量化，即代谢通量。浓度和通量并不总是可靠地一致。在代谢中，代谢物的积累不仅可能是由于产生增加，还可能是由于消耗减少。例如，当从酵母中去除葡萄糖时，糖酵解流出急剧下降，导致较低的糖酵解中间产物的积累，尽管途径流入减少。由于代谢物水平和通量提供了互补的信息，因此通过研究两者可以更好地了解代谢。

与代谢物不同，通量不是可以在质谱仪中测量的物理实体。然而，可以通过同位素示踪来推断通量。经典的放射性示踪剂研究为现代对新陈代谢的理解奠定了基础。今天，类似的研究可以使用质谱或核磁共振来广泛而定量地追踪非放射性稳定同位素示踪剂的命运。为了在系统层面量化通量，需要使用计算模型将大量示踪数据集成起来。但即使没有这样的计算，通过对同位素示踪实验的直观解释仍然可以获得有价值的生物学洞察力。此外，直观解释通常可以通过使用方程来量化关键通量或通量比来进行补充。这样的定向同位素示踪方法与代谢组学一起在这里进行介绍。一、代谢组

代谢物由一系列耦合的酶反应网络产生和消耗，将输入的营养转化为可用的能量和生物质。在稳态下，每种代谢物的定量流入和流出必须平衡。代谢网络的规模因生物体而异，从大约500个到几千个反应和水溶性代谢物不等。这些代谢物的结构在从细菌到人类的各个生物中基本相同。这反映了所有生物体都需要核苷酸、氨基酸和脂肪酸来合成DNA/RNA、蛋白质和细胞膜的事实。几乎所有生物都合成或消耗葡萄糖，而纤维素是地球上最丰富的生物高分子。因此，大约有100种高通量化合物始终是主要的代谢组分：氨基酸、核苷酸以及糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸循环的中间产物。

与代谢的有限核心相比，生物系统中的小分子的完整范围是庞大的。它包括其他功能重要的代谢产物：酶的激活剂和抑制剂；大分子修饰的供体和调节体；信号分子，包括神经递质和激素；物种间战争的介质，如抗生素；以及结构和能量储存分子，如脂质。由于脂质非常丰富且其性质与水溶性代谢物不同，脂质的测量形成了自己的“组学”领域（脂质组学）。除了内源代谢物外，食物链中较高层次的生物体还包含其他物种制造的次生代谢产物。人体样本通常还含有药物、人工香料和其他外源物质及其代谢副产物。

除了已知的代谢产物之外，对未知代谢组的研究引起了极大的兴趣。尽管基因组测序可以揭示生物体中的所有基因和蛋白质，但由于未知蛋白质的催化潜力、酶的多功能性以及来自食物的代谢输入的多样性，代谢产物的完整集合仍然难以定义。观察到基于质谱的代谢组学研究中大多数峰值仍未被鉴定，增加了对未知代谢组的兴趣，尽管这些峰值中的许多是分析假象。然而，新的代谢产物和反应肯定还有待发现。

二、代谢组学

代谢组学，无论是否涉及同位素示踪，包括三个基本步骤：（1）样品准备，（2）代谢组测量，以及（3）数据分析。

(1)样品制备

在代谢组学中取得成功始于选择合适的实验。在这方面，希望读者能受到下文描述的一些生物应用以及下面表格的启发，该表突显了许多不同的同位素示踪剂及其实用性。在本节中，专注于代谢组学研究中的基本设计问题，这些问题适用于许多应用领域。

对营养环境的控制尤为重要。对于体内研究，这意味着需要密切关注饮食、禁食和饮食组成。对于细胞培养研究，这意味着要特别注意培养基的选择和培养基更换的时机。通常情况下，化学成分确定的培养基通常优于复杂的生物培养基，如溶源肉汤 (LB)。对于哺乳动物细胞培养，使用市售的透析胎牛血清可以避免血清代谢物造成的混淆。

对于同位素示踪研究，通常最好在引入示踪剂时避免代谢扰动，即保持“代谢稳态”。这可以通过将特定的养分从未标记形式更改为标记形式，切换到其他方面相同的培养基来实现。标记的持续时间取决于感兴趣的代谢途径以及是追求动态数据还是稳态数据。在培养细胞中，通过大约10分钟实现糖酵解的稳态标记（即“同位素稳态”），而通过大约2小时实现三羧酸循环的稳态标记，核苷酸的标记需要大约24小时。需要非常迅速的采样来捕捉糖酵解标记的动态过程（例如，10秒的时间尺度），而可以通过在15、30、60和120分钟等时间点进行采样来探测三羧酸循环的动态过程。进行为期一天的实验通常便于收集稳态标记数据。

另一个关键问题是收集代谢产物。对于细胞和组织来说，这是一个特殊的挑战，因为许多重要的代谢产物在几秒内就会自然周转。因此，获得准确的代谢物谱需要几乎立即停止代谢活动。这仍然是一个积极研究的领域。典型的方法包括冷冻和/或酶变性。已经报道了各种提取和灭活的方案。对于培养细胞，一个简单的方法是在去除培养基后立即通过抽吸（对于附着细胞）或快速过滤（对于非附着细胞）添加冷有机溶剂。低温会迅速减慢新陈代谢，有机溶剂会使酶永久变性。最好避免可能改变代谢的操纵，比如在灭活代谢之前沉淀或洗涤细胞。

对于组织标本，最实际的方法是先冷冻，然后提取。通过在液氮温度金属板之间粉碎组织，可以实现快速冷冻，这一技术被称为Wollenberger夹具。由于传热效果更好，这比直接将组织碎片放入液氮中要快得多。然后，可以将组织存储在-80°C，通过研磨粉碎，然后用冷有机溶剂提取。在采样之前和期间必须小心避免代谢的改变。这并不简单，因为麻醉或安乐死都可能引起代谢变化。事实上，即使是实验者（或医生）的视线也可能引发改变新陈代谢的压力反应。

另一个复杂因素是有机溶剂可能无法立即停止酶活性。持久的催化活性对于高能化合物如NADPH和ATP是一个特殊问题。这些丰富代谢产物的降解产物本身是生物学上重要的代谢产物，即使NADPH的轻微降解也会显著增加NADP，而ATP的显著降解也会增加ADP和AMP。对于对这些化合物感兴趣的生物学家，建议使用有机溶剂和酸的组合进行提取，因为酸可以加速酶的变性。具体而言，发现40:40:20乙腈：甲醇：水与0.1 M甲酸的混合物，然后在几分钟后加入碳酸氢盐以中和样品，能有效地捕获这些代谢产物。未来可能会有更好的方法进行进一步的研究。

代谢组学采样的固有挑战使得验证性测量变得尤为重要。例如，特定的基因扰动是否会在从麻醉和安乐死的小鼠的肝脏中采样时产生相同的代谢变化？另外，某些代谢产物可以直接在体内测量，例如使用荧光报告基因。与此同时，重要的是要认识到即使是不完美的样本收集也可能提供有价值的见解。在临床研究中，组织采样通常会发生一些延迟，但这是对人类数据益处的合理权衡。

（2）质谱分析

拿到提取物后，面临的挑战是尽可能准确地测量尽可能多的代谢物。在代谢组学的早期阶段，常用一维质子核磁共振（NMR）来生成代谢组图谱。虽然峰可以被指定给功能团，但大多数峰反映了来自多个代谢物的集成信号。通过多维NMR，这些局限性已经得到部分解决，而且由于其结构阐明、体内代谢物测量和通用检测的能力（几乎每个代谢物都包含质子，因此产生质子NMR信号），NMR仍然在代谢组学中发挥着重要作用。然而，由于质谱具有无与伦比的能力，可以检测低丰度代谢物而不受与之相近物种的干扰，研究者们越来越多地依赖质谱。

这反映了现代质谱仪卓越的分辨率和灵敏度。在质谱中，分辨率被定义为m/Δm的比率，其中m是分析物的质量，Δm是可以区分的最小质量差异。实现高分辨率允许独立测量质量差异较小的代谢物。例如，肌酸（C4H9N3O2）和亮氨酸（C6H13NO2），在正离子模式下的精确质荷比分别为132.076和132.102，可以在4000分辨率下区分。对于同位素示踪，高分辨率可以区分用不同重核标记的物种。例如，带有一个2H和一个13C的M+1棕榈酸酯同位素异构体可以在100,000质荷比分辨率下分离。

要被质谱检测，液体提取物必须被电离。这通常是通过电喷雾电离实现的：在液体从针尖流出时施加高电压，将液体转化为最终生成气相离子的微小带电液滴。

电喷雾电离是一种相对“温和”的电离过程，通常产生完整的（去）质子化代谢物离子，在正离子模式下为（M+H）+，在负离子模式下为（M-H）−。然而，它还会生成多种加合物（例如[M+Na] +）和碎片，这使得所得的质谱和下游数据分析变得复杂。

在代谢组学中常用的质谱仪有飞行时间质谱仪（TOF）、轨道阱和四极杆。这三者都在电场中操控离子。TOF仪器使离子在一根飞行管中竞速。首先，通过电压降（ΔV）加速离子以赋予其动能。然后，离子的速度取决于其质荷比（m/z），质荷比较低的离子在飞行管中飞行得更快。当前的TOF仪器通常具有10,000至60,000的质荷比分辨率。Orbitrap 仪器监测纺锤形电极上下的离子振荡。离子被注入轨道阱并绕主轴旋转，静电引力通过向心力平衡。由于纺锤体的形状，离子也会沿着其长轴振荡，这些 z 轴振荡的频率仅取决于离子 m/z。这些振荡的频率可用于确定 m/z，分辨率超过 100,000，甚至高达 1,000,000。尽管成本较高，但离子回旋共振仪器可以实现更高的分辨率，其中循环离子运动是由强磁场引起的。

与TOF和orbitrap等高分辨率质谱仪不同，四极杆充当低分辨率质量过滤器，过滤掉除了特定感兴趣的m/z以外的所有离子（±0.5 dalton）。四极杆通常放置在高分辨率质谱仪的前面，以制成混合质谱仪，如四极飞行时间（Q-TOF）。这使得能够分离特定质量的离子，然后进行碎片化（通过与惰性气体碰撞）并对碎片离子进行高分辨率分析。由此产生的串联质谱（MS/MS）谱反映了母离子的结构，并可用于代谢物的鉴定。或者，四极杆可以在没有高分辨率质谱仪的情况下串联放置，制成三重四极杆仪器。三重四极杆仪只测量预定义的目标离子子集，但对于测量单一分析物提供了最佳灵敏度。

（3）色谱法

通过在质谱测量之前在柱上物理分离分析物，色谱法增强了代谢组学的覆盖范围，并提高了质谱的定量准确性。色谱法尤为重要，因为电喷雾电离过程具有竞争性质；丰富的离子会抑制共离子化物质的信号。色谱分离减少了离子抑制，改善了对低丰度物种的检测。它还可以防止定量伪影，其中丰度物种浓度的变化系统地改变了其他共离子化代谢物的信号强度。

色谱法的另一个优点是异构体的分离，异构体是具有相同分子式但不同结构的化合物，例如亮氨酸和异亮氨酸。异构体在新陈代谢中很常见。例如，磷酸己糖有十多种异构体，每种异构体都有不同的生物学作用。通过简单的 MS 无法区分异构体，但可以通过色谱法和/或 MS/MS 碎片模式来区分。

色谱法对于区分真实代谢产物信号和在电离步骤中由于高电离能而导致的代谢产物碎裂引起的伪信号也至关重要，这时一些代谢产物可能分解成与其他代谢产物具有相同m/z的碎片。例如，柠檬酸的碎片模拟了四种不同的羧酸代谢产物。ATP的碎片模拟ADP和AMP。因此，尽管没有色谱法的直接质谱分析可以以高通量检测大量离子，但它容易受到许多假阳性和假阴性的影响。

色谱法和质谱通常被耦合在一起，例如气相色谱-质谱（GC-MS）或液相色谱-质谱（LC-MS）。气相色谱要求分析物蒸发，并根据它们在气相（“流动相”）和色谱柱内的液层（“固定相”）之间的分配进行分离。它最常与质谱耦合，采用电子电离作为硬电离技术，产生一组特征性的碎片代替完整的代谢物离子。可以通过保留时间并将碎片模式与光谱库进行匹配来识别峰。相对于液相色谱，气相色谱具有更优越的色谱分辨率，尤其适用于测量低分子量（例如乙酸）、高挥发性（例如醇类）或电喷雾电离下离子化较差的分析物（例如甾醇）。通过化学衍生，它还可以测量中等大小的带电代谢物，如糖单磷酸。

液相色谱通过在柱内填充的溶剂和微米级珠子之间的分配对代谢物进行分离。反相（RP）色谱法涉及疏水小珠（通常为C18）和使用从水到有机溶剂的梯度洗脱。它适用于许多极性代谢物和脂质，但不能保留亲水性代谢物，如氨基酸。对于含有多个磷酸基团的代谢物，如ATP，它也产生较差的峰形。这些不足可以通过向运行缓冲液中添加适度疏水的阳离子，如三乙胺，来进行校正，它充当离子配对剂，有助于将阴离子代谢物结合到色谱柱上。然而，阳离子配对剂在正模式下会导致严重的离子抑制，并且需要数周才能从LC系统中清除；因此，需要一个专用于负模式分析的系统。

亲水相互作用色谱（HILIC）涉及亲水性小珠，以及从有机溶剂到水的梯度洗脱。在过去的十年中，HILIC方法取得了显著的进展，允许在同一仪器上进行正模式和负模式的分析。有多种HILIC柱的化学成分可供选择。在这些中，发现酰胺树脂对于测量核心代谢组特别有效。另一种适用于测量核心代谢组的液相分离方法是毛细管电泳，其中分离基于通过液体的差异电压驱动而非柱上相互作用。

（4）数据处理

数据分析的第一步是将原始质谱数据转换成一个带有峰标识和样本间强度的注释表。这涉及到计算算法，用于选择峰，使它们在样本间对齐，并量化峰的强度。在典型的液相色谱-质谱（LC-MS）运行中，大多数>10,000个峰都反映了环境污染物、加合物或源内碎片，而不是代谢物分子离子，可以忽略不计。有趣的峰可归为两类：（1）它们对应于已知代谢产物；（2）它们在不同的生物条件下有显著差异。

鉴于一种经过良好注释的色谱法，可以基于准确的质量和保留时间识别已知代谢产物。开源软件Maven（现在维护为 ElMaven）专门设计用于提取已知代谢产物峰的强度和标记模式。在具有准确的色谱保留时间库（使用代谢产物标准测量）的情况下，Maven或相关的商业软件可以轻松查看原始离子特异色谱图，并将这些原始数据流程化为已知代谢产物信号强度的表格。

为了找到不同生物条件下的峰，广泛使用开源程序XCMS。它可以识别显着变化并有助于搜索 MS/MS 谱图匹配。XCMS 还可以通过基于网络的平台在线访问。可以通过匹配已知标准品的保留时间和/或碎片模式来识别峰。通过MS/MS测量的碎裂图谱在仪器之间相当一致可以通过搜索 MS/MS 谱数据库（例如 HMDB、METLIN）来识别代谢物。当没有找到MS/MS匹配时，MS/MS仍然可以提供关于未知化合物中存在的官能团的线索。然而，对于小分子结构的阐明，核磁共振（NMR）仍然是黄金标准。

（5）解释

解释代谢组学数据的起点是理解信号强度和浓度之间的关系。在质谱中，对于任何给定的分析物，信号强度（以离子计数测量）通常与浓度呈线性关系。因此，可以基于离子计数的倍增变化推断相对量。然而，不同化合物的响应因子（例如电离效率）差异很大。因此，绝对定量需要与标准品比较。最好的方法是在淬火时添加同位素内标。由于许多代谢物并没有同位素标准品，因此有时标记生物样品更容易（例如，通过在[U-13C]葡萄糖中培养细胞）。一旦对参考条件的绝对代谢物水平有所了解，就可以通过相对定量确定其他条件中的绝对水平。以浓度为考量，而不是任意的信号强度，有助于将研究结果置于情境中。例如，当在特定条件下代谢物上升时，它是否影响渗透压？或者它仍然只存在微量？浓度如何与消耗酶的Km值相关？

可视化代谢组学数据集中浓度变化的整体模式的一个好方法是使用聚类热图，可以使用免费开源工具生成（例如Cluster 3.0和Java Treeview）。样品中显示相似模式的代谢物组合在一起，如树状图（树形图）中所反映的那样。

热图也可以用于将显示相似代谢响应的样本分组在一起。评估样本之间的整体相似性或差异的一种更精细的方法是主成分分析，它可以识别最能区分样品的代谢物的线性组合。沿着前两个主要成分绘制样品的位置，以图形方式突出显示哪些样品具有相似的代谢物特征。此类图可以通过 MetaboAnalyst等免费软件生成。

数据分析的另一个方面是查找在不同条件下显著变化的代谢物（或标记模式）。这可以使用标准统计检验来完成。由于代谢组学研究测量许多代谢物，因此仅凭偶然性（平均为 100 中的 5），预计某些代谢物的 p 值将 < 0.05。为了降低错误发现率，应使用 Benjamini-Hochberg 过程调整 p 值。错误发现纠正后的重要发现可以在条形图中突出显示。

对于同位素示踪，可视化标记模式的一种便捷方法是堆叠条形图，其中每种颜色代表特定的标记形式。在分析标记数据之前，校正天然同位素丰度非常重要。最大的贡献者是 1.1% 的天然碳 13 丰度，但最好校正所有相关的天然同位素，同时考虑到所使用的示踪剂和质谱仪的分辨率。为此目的而存在软件。标记分数为标记形式的绝对量值提供补充信息。

在查看了聚类热图并逐个检查变化的代谢物后，数据中的关键信息通常开始浮现。为了促使这一过程，通常通过检查其结构、使用类似KEGG或MetaCyc的通路数据库检查其产生和消耗途径，并通过Google或PubMed搜索已知的生物学关联，来“了解”显示出有趣浓度或标记变化的不熟悉的代谢物。还开发了软件，以帮助基于在特定实验中显示出水平改变的通路代谢物的比例来识别受影响的通路。

三、生物应用

在这里，重点介绍代谢组学和同位素示踪可以阐明生物学的四种一般方式。 在每种情况下，都会讨论选定的成功实验。目标不是回顾代谢组学和同位素追踪的贡献，而是讨论一小部分实验，以激发新用户的兴趣。

a、寻找特定的代谢物

代谢组学最强大的应用之一是寻找具有特定生物学作用的代谢物。一个简单的情况涉及识别酶的底物。对于新的或非特异的酶，生理底物在生物化学上可能难以识别。现在有许多成功利用代谢组学进行这一目的的例子。典型的实验设计涉及敲除酶并寻找代谢组的变化。在大多数情况下，酶敲除导致生理底物的积累，而 XCMS 等软件可以有效地从非目标 MS 数据中提取这些峰。

代谢组学还可以识别意想不到的酶产物。一个特别重要的案例涉及导致人类癌症的 TCA 循环酶异柠檬酸脱氢酶（IDH1 和 IDH2）的活性位点突变体。虽然最初的生物化学提示这些突变酶是无活性的，但代谢组学分析显示，表达致癌突变 IDH 的细胞具有正常量的酶的典型底物和产物，但三个意外的 LC-MS 峰急剧增加。这三个峰都在单一保留时间点发生，表明它们都起源于单一代谢物。其中一个峰被证明是突变酶产生的代谢错误产物 2-羟基戊二酸的分子阴离子。另外另外两种是钠加合物和源内脱水产物。随后的研究表明，2-羟基戊二酸通过抑制组蛋白和 DNA 去甲基化而导致癌症。

代谢组学还可以用于识别与更复杂生物学功能相关的代谢物。一种方法是从引发感兴趣的生物反应的提取物开始。可以使用大小过滤、有机萃取或热处理来确定活性是否存在于小分子或大分子（例如蛋白质）中。当活性存在于小分子中时，代谢组学可以识别其中存在的物质。然后可以将提取物纯化成级分，寻找与生物活性一致的MS（或NMR）峰。这种方法成功地识别了氨基酸缬氨酸的代谢产物3-羟基异丁酸，作为跨血管内皮细胞脂肪运输的诱导剂。

也许最大的兴趣在于识别与常见人类疾病相关的代谢物，以用作诊断或预后标志物。代谢物在发挥这种作用方面的潜力已经得到充分验证，葡萄糖和胆固醇的测量在现代医学中至关重要。重要的是，葡萄糖和胆固醇浓度的轻微变化（例如50%）被用于指导诊断和治疗。为了通过代谢组学找到类似的生物标志物，需要大样本量。为了减少选择峰和假发现的统计机会，迄今为止，人类常见疾病最成功的代谢组学研究都集中在已知的代谢物上。例如，为了发现能够预测2型糖尿病发展的代谢物，通过 LC-MS 对 Framingham 后代研究中跟踪 12 年的 2,422 名个体样本进行了分析，重点使用三重四极杆 MS 分析核心代谢组。这揭示了支链氨基酸（BCAA：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）浓度的适度增加（30%）预测未来胰岛素抵抗。由于在这种基于人群的人类研究中很难证明因果关系，因此在小鼠模型中寻找相同的表型是有价值的。事实上，在标准小鼠糖尿病模型中很早就发现了支链氨基酸升高。这些模型现在被用来确定支链氨基酸升高的机制以及这种升高如何影响发病机制。总的来说，这些研究强调了代谢组学在寻找具有特殊生物学重要性的代谢物方面的效用，包括癌症和糖尿病这两种最常见疾病的新驱动因素。

b、纵观全局

除了发现特殊重要性的代谢物之外，代谢组学的一个关键优势是全局视角。在许多情况下，通过看到多个相关代谢物同时变化来增加信心。显著的例子包括糖尿病患者中所有三种支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）水平升高，以及自闭症患者中三种不同的烟酰胺相关代谢物水平升高。同样，虽然各种乙酰化亚精胺种类先前已被认为与癌症有关，但在这些代谢物在多项代谢组学研究中成为最强的癌症预测因子后，人们对这些代谢物作为生物标志物的兴趣大大增加。

除了将特定的代谢变化置于背景中之外，代谢组学还可以揭示一般的生物学原理。 例如，微生物的多项代谢组学研究支持这样的概念：代谢对遗传变化相对稳健，但对营养环境敏感。在大肠杆菌和酵母中，酶的单次敲除对整体代谢组影响不大，主要是代谢物直接在被消除的酶上游积累。转录因子和信号蛋白的敲除突变体在代谢组中表现出更弱但更广泛的变化，这些变化相对微妙，但反映了基因的功能。相反，营养环境的变化导致代谢物浓度的大规模全局变化。为什么中心代谢酶的敲除通常只产生局部代谢变化，而养分匮乏产生全局代谢变化？代谢网络包含多个部分冗余的途径，可以绕过许多堵塞。但元素营养素是无可替代的。更一般地说，由于底物可用性对通量的强烈影响，代谢与营养环境密切相关。对养分限制的强烈代谢物变化可能具有多种好处：提供养分条件的稳健胞内信号；在艰难的养分环境中优化生存和生长；并在养分条件改善时为细胞迅速恢复做好准备

代谢组学还可以与其他组学方法相结合。这些努力的一个重要目标是了解不同生物分子类别的调控相互作用。这通常通过动态测量来促进。例如，对拟南芥植物对光/暗循环的反应进行的一系列代谢组学和转录组学测量发现，黑暗会快速诱导蛋白质降解基因。随后氨基酸水平增加。氨基酸水平的增加反过来触发氨基酸生物合成基因的下调。这种“组学驱动的假设”的产生是有价值的，最终的证据在于检验因果关系的验证性基因实验。

c、追踪代谢路径

代谢组学测量代谢产物的丰度。虽然提供信息，但代谢物丰度并不能揭示途径活性：代谢物水平由生产和消耗的平衡以非线性方式决定。代谢水平增加可能是由于生产速度加快或消耗速度减慢所致。区分这两种选择通常是至关重要的。例如，当代谢产物在疾病状态下的产生增强时，抑制该途径是合理的。因此，使用同位素示踪探测途径通量具有很大的价值。

这可以通过引入同位素示踪剂并测量下游代谢物标记的动态来实现。直观地说，更快的标记意味着更高的通量。实际上，对于直接由示踪剂制成的代谢产物，标记累积的初始速率（以摩尔浓度或每个细胞的摩尔数来测量，而不是标记分数）等于反应的通量。对于此类代谢物，假设代谢稳态，通量也可以根据标记半衰期和代谢产物池的大小计算：通量 = ln 2 × 池大小 / t1/2。然而，对于更下游的代谢产物，标记动态取决于示踪剂和测量分析物之间所有代谢物的通量和池大小。例如，糖酵解和PPP通常以相似的速率标记，反映了葡萄糖-6-磷酸的标记，尽管糖酵解具有更高的通量。

另一种方法涉及确定同位素稳态下的标记模式。这样的实验有利于避免在许多不同时间点进行测量的需要。例如，为了评估相对于糖酵解的PPP通量，使用位置标记葡萄糖的稳态标记比使用 [U-13C]-葡萄糖的动态标记更有效。一种有效的示踪剂是选择性在碳1和2上标记的葡萄糖（[1,2-13C]葡萄糖）。该示踪剂通过氧化 PPP（而非糖酵解）进行分解代谢，可产生 M+1 标记的糖酵解代谢物。由于自然同位素M+1信号相当大，因此对自然同位素丰度进行正确校正至关重要。此外，将标记模式与途径活动精确关联非常重要。例如，[1,2-13C]葡萄糖特异性地探测氧化性 PPP 产生的 5-磷酸核糖通过非氧化性 PPP 回到糖酵解的通量。如果核糖用于核苷酸合成（如增殖细胞中发生的那样），则糖酵解中不存在 M+1 特征。下表提供了用于解释生成的标记模式的跟踪器和启发式列表。它包括简单且广泛使用的方法，例如均匀添加 13C 标记的营养物质并确定它们对 TCA 中间体的相对贡献，以及使用位置标记示踪剂探测特定通量的巧妙方法。随着通量分析领域的成熟，希望这种启发式方法将得到越来越好的验证和广泛使用。

目前，仔细思考代谢途径中涉及的原子转化以及它们与观察到的同位素标记模式的关系仍然非常有价值。这种分析可以识别具有生物学意义的意外通量。一个重要的例子涉及在喂食[U-13C]谷氨酰胺的哺乳动物细胞中对柠檬酸盐进行M+5标记。谷氨酰胺代谢的标准代谢途径涉及其转化为α-酮戊二酸，随后在TCA循环中进行α-酮戊二酸的氧化代谢，产生M+4柠檬酸。相反，α-酮戊二酸的还原羧化产生 M+5 柠檬酸。通过使用选择性在其第一个碳上标记的谷氨酰胺（[1-13C] 谷氨酰胺）进行追踪，并最终通过 IDH1 敲除后显示 M+5 柠檬酸盐的损失得到了严格证明。随着这些努力更完整地绘制新陈代谢的功能能力，同位素示踪将变得更加适用于更广泛的生物学社区。

d、多细胞生物的示踪

在通量分析中，最前沿的是追踪活体动物。从生物化学的一开始，同位素示踪剂就被用于植物和动物——但现在借助代谢组学的力量，此类研究正在被重新审视。与细胞培养研究或孤立微生物研究相比，解释更为复杂，因为任何给定组织中的标记不仅反映了其组成细胞的平均标记，还反映了示踪剂的药代动力学，即示踪剂及其代谢产物的循环水平。

为了应对这种复杂性，一些相对简单的计算是有价值的。对于动物研究，一个关键变量是同位素示踪剂输注速率。可以根据对循环营养物的内源产生和消耗速率的了解来确定实现特定目标富集在循环中所需的示踪剂输注速率，在稳定状态下，这些速率必须平衡并被称为营养素的循环周转通量：Fcirc = R(1 – L)/L，其中R是输注速率，L是血浆代谢产物的标记。通常最好实现在10%–30%的富集范围内，以尽量减小对循环代谢产物水平的干扰，同时有足够的示踪剂以观察下游产物的标记。

另一个有用的测量是血液中循环营养物对下游组织代谢产物水平的分数贡献。例如，谷氨酰胺对TCA循环的贡献有多大？这可以通过注入标记的谷氨酰胺直到组织标记达到稳态来探究。要估计谷氨酰胺的TCA贡献，最简单的方法是将组织TCA中间产物的标记除以血清谷氨酰胺的标记。当营养物质主要在组织内分解代谢时，这种方法效果很好。对于谷氨酰胺而言，尽管在培养的癌细胞中它对TCA循环的贡献最大，但在体内的肿瘤中，它是次要的贡献者。当输入的营养物也可以通过转化为另一种循环代谢产物间接供给组织时，就需要采用更复杂的方法。为了确定不同营养物的直接贡献，需要对所有感兴趣的循环营养物进行示踪实验（例如，葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺）。通过了解每个示踪剂对每种循环营养物的标记以及组织标记数据，然后可以通过简单的矩阵计算确定每种营养物的直接贡献。使用这种方法，发现从输入的葡萄糖中的TCA标记主要通过循环的乳酸进行：某些细胞将葡萄糖分解为乳酸，将其分泌到循环中，并用作大多数组织甚至肿瘤的主要TCA底物。通过这种方式，糖酵解和TCA循环在各个组织中解耦，实现了它们的独立组织特异性调节。因此，动物中的示踪可以揭示生物体代谢的新设计原则。

四、未来发展方向

代谢组学的一个重要方向是分析程序的标准化。 这解决了几个需求。首先，虽然分析的各个步骤并不是特别复杂，但构建有效的集成工作流程仍然很棘手。其次，需要色谱标准化，以实现跨实验室的峰身份有效共享。经过严格审查的精确质量和保留时间的文库最终应该能够实现已知代谢物的自动定量。标准化程序还应包括将带注释的数据表（包括测量的质量、保留时间和单个样品峰值强度）发布到公共存储库。随着仪器的不断改进、实验方案的标准化以及数据分析和共享的自动化，代谢组学有望在未来十年内为生物学家提供越来越广泛的应用和帮助。

前沿方向是什么？一个迫切的需求是更好地理解代谢物的范围。许多实验室现在常规测量的约200种水溶性代谢物与LC-MS运行中发现的约10,000个峰之间存在巨大的差距。这种差距的大部分是由于个别代谢物产生许多不同的离子，这是由于成分形成和源内碎裂导致的。然而，在考虑了这些现象之后，未知的代谢物可能仍然多于已识别的代谢物。

Products of Interest

Catalog No. Description

CLM-420

D-Glucose (1-13C, 98-99%)

CLM-746

D-Glucose (2-13C, 99%)

CLM-504

D-Glucose (1,2-13C2, 99%)

CLM-2717

D-Glucose (1-13C, 99%; 6-13C, 97%+)

CLM-6750

D-Glucose (3,4-13C2, 99%)

CLM-4673

D-Glucose (1,2,3-13C3, 99%)

CLM-1396

D-Glucose (13C6, 99%)

DLM-349

D-Glucose (6,6-D2, 99%)

DLM-2062

D-Glucose (1,2,3,4,5,6,6-D7, 97-98%)

CDLM-3813

D-Glucose (13C6, 99%; 1,2,3,4,5,6,6-D7, 97-98%)

CLM-1579

Sodium L-lactate (13C3, 98%) 20% w/w in H2O

CLM-1578

Sodium L-lactate (3-13C3, 98%) 20% w/w in H2O

CLM-3612

L-Glutamine (1-13C, 99%)

CLM-1822-H

L-Glutamine (13C5, 99%)

NLM-1016

L-Glutamine (α- 15N, 98%)

NLM-557

L-Glutamine (amide-15N, 98%+)

NLM-1328

L-Glutamine (15N2, 98%)

CNLM-1275-H

L-Glutamine (13C5, 99%; 15N2, 99%)