EB分子中的锭是由一个苯基和一个三环菲锭环构成，苯基可以绕三环菲锭环旋转，而三环菲锭环是一个整体，呈扁 平状，十分类似于DNA结构中的AT碱基配对，故能以与DNA螺旋轴线垂直的方式嵌入到DNA碱基对之间。其结合力是范德华力和碱基相堆积力，其外围的苯基和乙基基团还能扣在DNA的大沟上，使结合更加稳定。插入DNA后锭与水脱离，而水是荧光淬灭剂，所以在DNA中锭的荧光强度恢复，荧光产率比溶液中游离锭的荧光产率高20-30倍。EB的荧光 需要波长为254 nm、302  nm或366  nm的激发光激发，但作用原理各不相同。254  nm的紫外辐射能量是先由DNA吸收（核酸在260  nm左右的光吸收特性）再将其传递给EB分子，302  nm和366   nm的紫外辐射能量是靠EB分子自身吸收。EB分子所得到能量在590 nm的橙红色光谱区以0.3的量子产率重新发射出来，所以DNA-EB复合物呈红色。由于254 nm紫外光对DNA的损伤较强，而在366  nm紫外光下EB产生的荧光又较弱，所以人们一般使用302  nm的紫外光来观察EB染色后的核酸。

EB与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性，在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个EB分子，此时  的DNA长度将增加27%。EB还可以结合到单链DNA或RNA分子内形成的较短的链内螺旋上，所以也可以检测单链DNA  或RNA，但是EB对单链核酸的亲和力相对较小，灵敏度较低。在凝胶中有EB存在的情况下，DNA的电泳迁移率会降低15%左右。