结直肠癌（CRC）是全球第四大致命癌症，每年有近90万人死亡。尽管治疗取得了越来越多的进展，但癌症相关死亡中结直肠癌的死亡率，特别是转移性结直肠癌的死亡率仍然很高。
此前TCGA和CPTAC结直肠队列中的研究揭示了结直肠癌的多组学特征和分子异质性。然而，这些研究更多地关注非亚洲人群中的非转移状态。因此中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（上海生物化学与细胞生物学研究所）曾嵘研究员、吴家睿研究员与海军军医大学第一附属医院（上海长海医院）张卫教授对中国人群的转移性CRC开展了相关研究，研究成果以题为“Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer”发表在Cancer Cell杂志上。该研究工作整合系统生物学理论，采用了大量的组学分析技术，对转移性结直肠癌（mCRC）基因组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学进行全面整合，揭示了不同亚型和转移的蛋白质组和磷酸化蛋白组特征。同时，利用蛋白-磷酸化关系对潜在肿瘤靶向药物进行评估，为CRCs的靶点和治疗评估研究提供了指导。
样本：146例患者，其中包括70名转移性CRC（mCRC）患者和76名早期非转移性CRC患者。从每位患者获取原发性肿瘤组织（T），远端正常组织（N），癌旁组织（P，正常邻近组织）和匹配的外周血细胞（BC）。其中针对mCRC还取样了远处肝转移组织（LM）。最终330例样本进行了全外显子测序，480例样本进行了DIA蛋白质组和DIA磷酸化蛋白质组分析。
组学技术：基因组学（全外显子测序、DNA甲基化芯片）、DIA蛋白质组学、DIA磷酸化蛋白质组学。
研究结果
1、中国CRC的突变特征
在146名CRC患者的原发性肿瘤中鉴定出107个非同义，体细胞，单核苷酸变体和7个插入或缺失，与TCGA CRC队列获得的结果相似。与以前的研究一致，CCRC队列中最常观察到的与癌症相关的突变是APC（65%突变频率），TP53（64%）和KRAS（32%）。CCRC队列与TCGA和MSK CRC队列的临床病理学特征存在差异，含有更高比例的转移性结直肠癌和直肠癌病例。与这两个队列相比，CCRC中的APC、TP53、BRAF和PTEN突变的频率明显更低，PRRC2A，PPFIA4，CPD和NURP1L基因的突变频率更高。
通过比较CCRC队列的非mCRC和mCRC中基因组改变的频率，研究团队发现：（1）与非CRC相比，mCRC原发肿瘤的突变负担降低。（2）在CRC中最常见的突变基因中只有SMAD4在mCRC患者的原发肿瘤中显示出显着更高的突变率；XIRP2在mCRC患者的原发性肿瘤中也显着高度富集。（3）SBS 1对mCRC的贡献率显着高于对非mCRC的贡献率，且先前已被报道为结肠癌和乳腺癌的转移特征。（4）mCRC患者的原发性肿瘤表现出更多的多克隆结构。
2、基于蛋白质组学数据的亚型分类
对原发肿瘤和远端正常组织之间的2440个差异表达蛋白质进行了共识聚类，将146个CCRC原发性肿瘤分为3个亚型：
1. CC1的特征是增加了RNA加工和DNA错配修复（MMR）。
2. CC2中上调的蛋白质富集细胞外基质（ECM）-受体整合，粘着斑和免疫相关途径。
3. CC3具有丰富的DNA复制和代谢途径上调功能。
三种亚型具有不同的无复发生存能力，与CC1和CC2亚型的mCRC患者相比，CC3中的mCRC患者表现出最差的无复发生存概率。非mCRC患者在三种亚型之间的无复发生存率没有显著差异。
3、磷酸化蛋白质组学谱将mCRC与非mCRC区分开
蛋白质组分型未将mCRC与非mCRC患者区分开。通过共识聚类发现，磷酸化蛋白组数据能将原发肿瘤与mCRC和非mCRC区分开来,划分出6种磷酸化蛋白质组亚型。SC1，SC3和SC5富含mCRC，而SC2，SC4和SC6是非mCRC的特征。功能富集分析发现SC1，SC3和SC5中高表达的磷酸化蛋白质富集在粘着斑和粘附连接途径。在SC2，SC4和SC6中上调的磷酸化蛋白质在ERBB2信号通路，子宫内膜癌，抗原加工和呈递以及FcγR介导的吞噬作用途径中富集。
4、转移性结直肠癌的蛋白质组学特征
对于mCRC，在原发性和转移性肿瘤中观察到突变谱之间的高度一致性。最频繁突变的SCNA在原发性和转移性肿瘤之间没有显示出差异，而转移性mCRC肿瘤与原发性肿瘤相比表现出更大的单克隆比例。总之，这些结果表明转移性肿瘤来自原发性肿瘤或来自相同的祖先克隆。蛋白质组学分析显示转移性肿瘤与原发性肿瘤明显不同，转移性肿瘤与正常组织相比具有更多的上调蛋白。这些差异表达的蛋白质清楚地区分了原发组织的转移组织。在每种亚型中，与正常组织表达不同的蛋白质在原发性和转移性组织之间也是不同的。
5、mCRC患者四种组织中的磷酸化位点与蛋白质的共变异关系
选取42名mCRC患者四种组织类型（N、P、T、LM），计算四种组织的磷酸位点丰度与蛋白质丰度之间的相关系数。结果表明，在所有CC亚型中，相关性均呈双峰分布，并明显向正值偏移。为了寻找三种CC亚型之间显著共调节的磷酸化位点与蛋白质的关系，使用ANOVA成功鉴定了三种CC亚型之间显著不同的954对磷酸位点-蛋白成对关系。CC2明显表现出更多的负调控相互作用，而CC3和CC1表现出更多的正相关。954对磷酸位点-蛋白质分为三个簇：CC1阴性（CC1neg），CC2阴性（CC2neg）或CC3阴性（CC3neg）。研究小组进一步将实验验证的或预测的激酶-底物对映射为CC1neg、CC2neg和CC3neg簇成员。利用超几何分布，为每个聚类选择了富集的激酶。通过进一步的实验结合通路富集分析的结果发现，激酶的磷酸化-蛋白共变异可能来自基因组变异，患者多种组织中磷酸化位点-蛋白的关系显示出与蛋白质组亚型相关的明显特征。
6、磷酸化蛋白质组学分析为mCRC提供可药物靶标
考虑到蛋白激酶已被开发为癌症治疗的可行药物靶点。通过进行激酶底物富集分析，研究发现不同CC亚型富含不同的激酶，同一CC亚型中的原发性和转移性组织对同一激酶显示出不同的活性。对于具有可定量蛋白质水平和临床可行药物的激酶，通过分析mCRC的42对N-T或N-LM组织中相应的磷酸化底物丰度，观察到mCRC患者的不同组织和蛋白质组学亚型中磷酸化底物和激酶的高度异质性。基于激酶-磷酸化底物之间的Pearson相关系数，构建了每种蛋白质组亚型中原发性和转移性肿瘤的激酶底物网络。在每种蛋白质组亚型中，原发性肿瘤和转移瘤之间的激酶-磷酸化底物网络存在显著差异，并且CC3网络与CC1的相似性大于与CC2的相似性。亚组内原发性和转移性肿瘤之间的激酶-磷酸底物网络的差异也大于亚型间原发性肿瘤的差异。这些观察结果表明在临床治疗中对相应抑制剂的个性化和定位特异性反应。
为了进一步探索mCRC患者药物反应的可能性，我们对31种miniPDX模型进行了三种激酶抑制剂（阿法替尼，吉非替尼和瑞格非尼）的药理学测试，包括9对原发转移性肿瘤和13种其他原发性肿瘤。通过肿瘤细胞生长抑制测量每种肿瘤对每种药物的药物反应效应，并确定来自同一个体的原发性和转移性肿瘤可能对相同药物表现出不同的反应。在指示治疗的适宜性方面，研究表明磷酸化蛋白质组读数可能比突变的存在更敏感。基于激酶-磷酸底物网络与药物敏感性之间的相关性。研究小组构建了基于1696个边缘强度特征的弹性回归模型，用于预测药物反应。结果表明，激酶-磷酸底物网络在预测mCRC患者的药物敏感性方面具有强大的潜力。
研究结论
本研究通过对转移性癌症的大规模组学研究表明蛋白质组学模式可以明确分类CRC患者的原发性肿瘤，并具有区分潜在预后结果的能力。转移和非转移CRC患者之间，原发性肿瘤的突变特征几乎没有差异。然而，组合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析在区分转移性和非转移性患者方面提供了最高的准确性。激酶-磷酸化底物分析网络分析可以准确反映药物反应，这为未来肿瘤药物的研究与开发提供了新的思路和方向。
蛋白质组技术推荐建议
此次分享的文献采用的是DIA蛋白质组学和DIA磷酸化蛋白质组学技术。事实上，蛋白质组学技术存在不同技术路线，以磷酸化蛋白质组为例，每种技术有其技术优势，可根据样本数量以及对数据质量的要求进行综合选择，例如样本数≥30例，就可以考虑用4D-DIA磷酸化蛋白质组技术。各类技术特点如下：
| 项目 | TMT磷酸化 | 4D Label free磷酸化 | 4D-DIA磷酸化 |
| 样本数量建议 | ≤16例 | ≤30例 | ≥30例 |
| 是否标记 | 标记 | 非标记 | 非标记 |
| 数据采集模式 | DDA | DDA | DIA（备注：建库用DDA) |
| 仪器 | 赛默飞Orbitrap系列仪器 | 布鲁克timsTOF Pro或Pro2 | 布鲁克timsTOF Pro或Pro2 |
| 细胞、组织检测能力* | 7000-30000（近2年项目，95%以上项目平均15000+） | 18000~40000 | |
| 技术特点 | 经典技术，混样检测，平行性好，缺失值极少，但一次实验样本数受标记试剂限制 | 一例例检测，实验设计灵活，位点鉴定准，但样本量大的时候，缺失值严重 | 一例例检测，大样本优选技术，缺失值少，位点鉴定准，定量更准 |
吉凯基因凭借多年在靶标筛选及验证服务领域的技术积累，建立的标准化 、工程化 、系统化的GRP平台，为中国研究型医生提供科研服务，加快科研成果转化。其中，多组学平台包含蛋白质组学平台和高通量测序平台：
·蛋白质组学平台拥有多台timsTOF Pro、Exploris 480高精度质谱仪，专业的Spectronaut Plusar、Mascot等分析软件，提供专业的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修饰组、olink蛋白质组等检测服务，强大的机器学习算法、IPA分析、蛋白基因组分析服务，系统的生物标志物、分子分型、药物靶点、基因功能研究等解决方案，真正让广大研究型医生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量测序平台分为常规测序服务和单细胞测序服务：单细胞测序拥有10x和BD两个平台，提供单细胞RNA-seq、单细胞核测序、单细胞混样RNA-seq、单细胞TCR/BCR、单细胞（RNA+ATAC）、空间转录组测序等服务；常规测序服务提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修饰测序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修饰测序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻译组测序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全转录组测序（两文库/三文库）、外泌体miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服务。