XFD660 马来酰亚胺是硫醇反应性染料，用于标记巯基，。XFD660 适合高级成像和流式细胞术应用。在pH 4-10范围内荧光不受影响且光稳定性好。XFD660 的马来酰亚胺衍生物通常用于与蛋白质、寡核苷酸或低分子量配体上的硫醇基团结合，产生的结合物与其他光谱相似的荧光团相比，荧光亮度明显更高，光稳定性更强。
马来酰亚胺在中性条件下很容易与蛋白质、经巯基修饰的寡核苷酸和其他含巯基分子中的巯基发生反应。所得的染料偶联物相当稳定。
AF660马来酰亚胺适用范围
标记抗体、蛋白质、硫醇修饰的寡核苷酸
AF660马来酰亚胺实验方案
溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等分，并在配制后储存在-20°C下。避免反复冻融。
1.蛋白质储备溶液（溶液A）
将100µL反应缓冲液（例如pH~6.0的100mM MES缓冲液）与900µL蛋白溶液（例如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白质标记储备溶液。
注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。
注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白稳定的抗体不能很好地被标记
注意：蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显著降低。为了获得好的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。
2.染料储备溶液（溶液B）
将无水DMSO加入XFD660 马来酰亚胺小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意：开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）并及时使用。染料储备溶液长时间储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存4周。避免反复冻融。
3.可选
如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用 DTT 或 TCEP 处理蛋白质生成硫醇基团。 DTT 或 TCEP 将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用 DTT，则必须在马来酰亚胺染料与蛋白质结合之前，通过透析或凝胶过滤除去游离 DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案：
1.在蒸馏水中制备 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鲜溶液。
2.在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT储备液。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。
3.将还原的 IgG 通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集 0.25 mL 馏分。
4.确定蛋白质浓度并将大部分 IgG 的组分合并。可以通过分光光度法或比色法来完成。
此步骤后尽快进行缀合（参见示例实验方案）。
注意： 为了获得好的结果，IgG 溶液得浓度应 >4 mg/mL。如果抗体低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。另外，需要增加 10% 来补偿在缓冲液交换柱上的损失。
注意：还原反应可以在 pH 7-7.5 的任何缓冲液中进行，例如 MES、磷酸盐或 TRIS 缓冲液。
注意：步骤3和4可以用透析代替。
样品实验方案
（该方案适用于山羊抗小鼠IgG与XFD 660 马来酰亚胺的偶联物标记。）
注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
进行偶联反应
1.使用10:1的摩尔比率（溶液B（染料）/A（蛋白质））作为起点：将5µL染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入蛋白质溶液（95µL溶液A）的小瓶中并充分摇晃。假设蛋白质浓度为10mg/mL，蛋白质分子量为~200KD，则蛋白质浓度为~0.05 mM。
注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。
2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联
（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）
1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。
2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。
3.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4.）。
4.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。
注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
表征所需的染料-蛋白质缀合物
取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的关键因素。 DOS 较低的蛋白质通常荧光强度较弱，而 DOS 较高的蛋白质也可能荧光强度减弱。对于大多数抗体，建议最佳 DOS 在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记，DOS 应控制为每摩尔抗体含有 5-8 摩尔 XFD660 马来酰亚胺。以下步骤概述了如何确定 XFD660 马来酰亚胺标记蛋白的 DOS。
检测吸收率
要测量染料-蛋白质缀合物的吸收光谱，请将样品浓度保持在 1 至 10 µM 之间。该范围内的确切浓度取决于染料的消光系数。
在 280 nm 处读取 OD（吸光度）和染料最大吸光度（对于 XFD660 染料，ƛmax = 663 nm）
对于大多数分光光度计，用去离子水稀释样品（来自柱馏分），直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范围内。蛋白质的最佳吸光度为 280 nm，而 XFD660 马来酰亚胺的最佳吸光度为 663 nm。为了确保读数准确，请确保结合物不含任何非结合染料。